Udo F. Schneider1, Dirk J. Schaefer2, Ulrich Kneser2 und Alexander Loch3:


1) Klinikum der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Universitätsklinik für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, Abteilung Poliklinik für Zahnärztliche Prothetik (Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. J. R. Strub)
2) Klinikum der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Chirurgische Universitätsklinik, Abteilung Plastische und Handchirurgie (Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. G. B. Stark)
3) Medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin, Universitätsklinikum Charité, Hals-Nasen-Ohren-Klinik und Poliklinik (Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. V. Jahnke)



Artikel zur Veröffentlichung eingereicht am 6.6.2001
Artikel im Netz freigegeben am 18.06.2001



Herstellung einer Silikonhohlform zur Züchtung menschlichen Knorpelgewebes



1. Einleitung
2. Ziel
3. Material und Methode
4. Ergebnis
5. Schlussfolgerung
6. Literatur



Zusammenfassung

Durch Tissue Engineering ist die Konstruktion lebender autologer oder allogener Zellverbände in geeigneten Matrixmaterialien möglich. In diesem Fallbericht wird gezeigt, wie es über eine Form gelingt, menschliches Knorpelgewebe auch in komplexer Form zu züchten.

Schlüsselwörter: Tissue Engineering, Ohrrekonstruktion, Knorpel, Knorpelersatz


Summary

Tissue engineering allows the construction of living autologous or allogenic tissues in suitable matrix materials. In this case report we show how even complex human cartilage can be cultivated by using a pre-defined mould.

Keywords: tissue engineering, ear reconstruction, cartilage, cartilage transplant


1. Einleitung

Tissue Engineering ist ein interdisziplinärer Bereich der Biotechnologie zur Lösung von medizinischen Problemen bei Gewebedefekten oder Organversagen. In diesem Bereich arbeiten Mediziner, Zellkulturtechniker und andere Bio-Wissenschaftler mit dem Ziel zusammen, komplette, lebende Gewebeersatzmaterialien herzustellen und dadurch Heilung heute noch unheilbarer chronischer, degenerativer Erkrankungen oder auch für akute Organversagen zu ermöglichen [1 - 4]. Dadurch bricht eine neue Epoche medizinischer Versorgung an. Was vor wenigen Jahren noch undenkbar war, ist heute Wirklichkeit geworden: Lebende, gesunde Zellen werden dem Körper entnommen, in hoch spezialisierten Laboratorien durch natürliche Teilungsprozesse unter Einbeziehung einer "Gussform" vermehrt und anschließend dem Patienten als Ersatz wieder transplantiert. Anders als bei künstlichen Implantaten akzeptiert der Körper bei dieser neuartigen Methode der Versorgung von Gewebedefekten ein solches Transplantat als körpereigenes Gewebe. Die Zellkulturtechnologie erlaubt die In-Vitro-Vermehrung fast aller menschlichen Zellen, so dass durch Tissue Engineering eine Konstruktion einer Vielzahl lebender autologer Zellverbände in geeigneten Matrixmaterialien für die rekonstruktive Chirurgie möglich ist. Bisher ist die klinische Anwendung im Wesentlichen auf den Hautersatz bei Schwerstverbrannten, zunehmend auch bei chronischen Hautulzera und Versuche mit Knorpelzellen beschränkt. Gelingt es in Zukunft, die Problematik einer optimalen dreidimensionalen Matrix, die Co-Kultur verschiedener Zellen, die Nutrition durch vorgegebene oder in-vivo induzierte Vaskularisation sowie die proliferative und differentielle funktionelle Steuerung zu lösen, wird es vielleicht schon in absehbarer Zukunft möglich sein, lebende autologe Gewebe und eventuell sogar Organe herzustellen.



2. Ziel

Ein zum Zeitpunkt der Operation 23-jähriger Patient erlitt im Rahmen eines Berufsunfalls unter anderem einen Teilverlust seines rechten Ohres (Abb. 1). Aufgabe war es, eine "Gussform" herzustellen, die es erlaubt, autologes menschliches Knorpelgewebe komplexer Morphologie defektorientiert zu züchten.

Abb. 1

Abb. 1:
Klinische Ausgangssituation

3. Material und Methode

Die Abformung des Ohrdefekts erfolgte nach Wattetamponade des äußeren Gehörgangs mit zwei unterschiedlich viskösen A-Silikonen der gleichen Produktreihe (Epiform flex® und Epiform solid®, Dreve, D-Unna), welche auch bei der Abformung von Kiefer- und Gesichtsdefekten im Rahmen der Epithetik Anwendung finden. Es folgte die Herstellung eines Situationsmodells aus Superhartgips (Fuji Rock®, GC Europe, B-Leuven), das gleichzeitig auch als Arbeitsmodell diente. Der Ohrdefekt wurde auf dem Arbeitsmodell unter Berücksichtigung der Defektmorphologie, aber auch des zu erwartenden ästhetischen Ergebnisses durch Modellierung ergänzt Das so ergänzte Modell wurde dubliert, in Superhartgips überführt und diente als Kontrollmodell. Das Arbeitsmodell wurde gegen Gips isoliert. Ein das Modell zirkulär umgebender Sockel wurde hergestellt und das entnehmbare Modell anschließend vertikal geteilt. Die Wachsmodellation wurde entfernt, und es folgte die Modifikation des Arbeitsmodells. Die das Knorpelgerüst bedeckende Hautschicht in dem dem Defekt angrenzenden Bereich wurde im Gips mittels Gipsfräsen entfernt, so dass in dem den Defekt begrenzenden Bereich ein Knorpelgerüst von etwa 1 mm Stärke stehen blieb. Der Defekt wurde im Sinn der Weiterführung des Knorpelgerüsts mit Provisorienkunststoff ergänzt (Tab 2000®, Kerr GmbH, D-Karlsruhe). Das so entstandene Knorpelgerüst wies eine maximale Schichtstärke von 1 mm auf. Das Kunststoffgerüst wurde zur Oberflächenverbesserung auf Hochglanz poliert und intensiv gereinigt (Abb. 2).

Abb. 2

Abb. 2:
Das Kunststoffanalogon zum Ersatz der fehlenden Knorpelsubstanz

Das Gerüst wurde mit Wachsdraht angestiftet. Der spätere Zugang zur Gussform erhielt einen Wachsdraht von 3mm Durchmesser, die späteren Entlüftungskanäle einen Wachsdraht von 2 mm Durchmesser. Ein zweiteiliger (Boden und Deckel), klartransparenter Kunststoffbehälter wurde im Bodenteil mit A-Silikon (Biopor AB®, Dreve, D-Unna) der Shore-Härte 40 beschickt, und das angestiftete Kunststoffanalogon in das Silikon eingelegt. Nach Aushärten des Silikons wurde der mit Silikon beschickte Deckelteil des Kunstoffbehälters auf den Bodenteil aufgelegt, nachdem zuvor die erste Silikonschicht gegen die folgende Silikonschicht isoliert wurde (Vaseline). Das Silikon wurde jeweils mit einer Druckbeaufschlagung von 2 bar für 20 min im Drucktopf ausgehärtet. Ober- und Unterteil der Form wurden getrennt, das Kunststoffanalogon wurde entfernt. Das Volumen der so entstandenen Hohlform wurde mit destilliertem Wasser bestimmt und die Form für den weiteren Gebrauch plasmasterilisiert (Abb. 3).

Abb. 3

Abb. 3:
Die Silikonhohlform, bereit zum Einbringen der Knorpelsuspension

Dem Patienten wurde in einem ersten stationären Eingriff eine Knorpelbiopsie vom rechten Rippenbogen entnommen (costa-sternaler Übergang). Dieser Rippenknorpel wurde im Zellkulturlabor mechanisch zerkleinert (kleiner 1 mm), und über Nacht in Kollagenase-Lösung belassen. Es erfolgte die Filterung durch mehrere Filter unterschiedlicher Porengrößen, abschließend durch einen Filter der Porengröße 40 µm. Danach wurden die erhaltenen Chondrozyten gewaschen und für das Wachstum ausplattiert. Nach 2 Wochen wurden die Zellen gelöst und in eine Fibrinogenkleberkomponente (aus Blutplasma) eingebracht. Diese Suspension wurde zusammen mit einer zweiten Komponente (Thrombin als "Härter") über eine Doppelkolbenspritze in die vorbereitete Hohlform eingebracht. Sie verfestigte sich durch Transformation zu Fibrin innerhalb von 15 Minuten bei 37°C derart, dass das entstandene Konstrukt aus der Silikonform entnommen werden konnte. Dieses Konstrukt wurde für 14 Tage kultiviert; dies führte zu seiner Reifung.
Der geformte Knorpel wurde dem Patienten in einem zweiten stationären Aufenthalt transplantiert und mit einem temporo-parietalen Faszienlappen sowie einem Spalthauttransplantat vom rechten Oberschenkel gedeckt (Abb. 4). Um die erreichte Form bis zur endgültigen Integration zu sichern, wurde eine Silikonschienung für den Patienten hergestellt (Abb. 5).

Abb. 4

Abb. 4:
Die intraoperative Situation


Abb. 5

Abb. 5:
Die Silikonschienung zur Sicherstellung der Form während der Einheilphase


4. Ergebnis

Zwölf Wochen post operationem, nach erfolgter Auswertung bildgebender Verfahren (Magnetresonanztomogramm), sowie nach palpatorischem Befund auf Formstabilität und Elastizität, stellt sich das Transplantat gut integriert dar. Es wird vom Patienten als körpereigen akzeptiert.




5. Schlussfolgerung

Das Ergebnis zeigt, dass im Rahmen des Tissue Engineering von menschlichem Knorpelgewebe durch Herstellung von Modellanaloga auch sehr komplexe Formen transplantierbaren Gewebes erzeugt werden können.



6. Literatur

  1. Bannasch, H., Horch, R. E., Tánczos, E., Stark, G. B.: Treatment of chronic wounds with cultivated autologous keratinocytes as suspension in fibrin glue. Zentralblatt für Chirurgie. 125 Suppl. 1: 79 (2000).


  2. Stark, G. B., Horch, R. E., Voigt, M., Tánczos, E.: Biologische Wundklebesysteme in der Wundheilung. Chirurgenkongreß (1998), Berlin, Sitzung Wundverschluß und Wundheilung, Vortrag Nr. 96).


  3. Stark, G. B, Bannasch, H., Schäfer, D. J., Bittner, K., Bach, A., Voigt, M.: Tissue Engineering: possibilities and perspectives. Zentralblatt für Chirurgie. 125 Suppl. 1: 69 (2000).


  4. Tánczos, E., Horch, R. E., Bannasch, H., Andree, C., Walgenbach, K.-J., Voigt, M., Stark, G. B.: Transplantation of keratinocytes and tissue engineering. Zentralblatt für Chirurgie. 124 Suppl. 1: 81 (1999).



Korrespondenzadresse:
OA Dr. Udo F. Schneider
Abteilung Poliklinik für Zahnärztliche Prothetik
Universitäts - Zahn-, Mund- und Kieferklinik
Hugstetterstr. 55
79106 Freiburg
E-Mail: schneidu@zmk2.ukl.uni-freiburg.de



Eine Printversion dieses Artikels wurde zur Veröffentlichung bei der Deutschen Zahnärztlichen Zeitschrift eingereicht
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